Les anticorps secondaires peuvent être classés en fonction de leur spécificité, qui peut être large ou étroite, et de leur type de fragment, qui peut être entier, F(ab) ou F(ab')2. 

Le principe du F(ab')2 est de générer des fragments d'anticorps divalents qui conservent les parties Fab liant l'antigène des anticorps IgG entiers tout en éliminant la majeure partie de la région Fc.

Les fragments F(ab')2 sont générés par digestion à la pepsine d'anticorps IgG entiers afin de cliver la région charnière et de laisser intacte une partie de la région Fc. Les fragments qui en résultent comportent deux portions Fab liant l'antigène et reliées entre elles par des liaisons disulfure, ce qui les rend bivalents avec un poids moléculaire d'environ 110 kDa. L'utilisation de fragments F(ab')2 présente plusieurs avantages par rapport aux anticorps IgG entiers, notamment une meilleure pénétration dans les tissus, une liaison non spécifique réduite aux récepteurs Fc des cellules vivantes ou à la protéine A/G, et la capacité de précipiter les antigènes. Toutefois, les fragments F(ab')2 ne sont pas recommandés pour le blocage car ils possèdent deux sites de liaison disponibles pour capturer l'anticorps primaire introduit ultérieurement. La préparation des fragments F(ab')2 implique la digestion à la pepsine des anticorps IgG entiers, suivie d'une purification à l'aide de techniques telles que la FPLC avec DEAE-